¹Ph.D. Profesor Asociado. Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ingeniería y Administración, Universidad Nacional de Colombia, Palmira, Colombia. Carrera 32 No 12-00 Barrio Chapinero. Teléfono 2868888 Ext: 34428. Email. lecortesp@unal.edu.co autor para correspondencia.

 ²Ph.D. Profesor titular. Departamento de Edafología y Química Agrícola, Universidad de Granada. Granada, España.

 ³M.Sc. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia, Palmira, Colombia.

 

ABSTRACT

 

This study aimed to determine  the  toxicity  of  Cu,  Cd, Ni, Pb and Zn in two  Colombian  agricultural  soils, Andisol and Vertisol, by bioassays with Lactuca  Sativa and Vibrio fischeri. The metals  were  individually  added to soils exceeding the intervention level of Andalusia. Subsequently,  they  were  incubated  at  25  °C   and   60% humidity for 60 and 90 days, respectively. The experimental design was completely randomized with three replicates. After each incubation, the concentration of the metals  in  aqueous  extracts  was  determined,  and bioassays were  carried  out  with  Lactuca  Sativa  and Vibrio fischeri. Statistical analysis of  results,  post  hoc comparisons (Tukey), correlations and principal component analysis were performed to find the factors that affected the organisms under study. It was found that Vertisol showed a higher immobilization capacity of all metals, based on their clay content and neutral pH, which was reflected in less toxicity on the organisms tested, indicating that this soil acted as a protection against mobility of pollutants in soil solution. The V. fischeri test presented greater sensitivity  to  contaminants,  allowing a better discrimination of toxicity levels. The ability of both soils to inhibit toxicity increased over time, possibly through the interaction of metals with the different soil components, and the decrease in their mobility by mechanisms such as the formation of stable complexes, and was related to the increase of pH.

 

Key words: Andisol, Contamination, Lactuca sativa, Vertisol, Vibrio fischeri.

 

 

INTRODUCCIÓN

En las últimas décadas, a nivel mundial, el contenido de metales pesados en suelos agrícolas se ha incrementado   (Huang   et   al. 2015). Su acumulación se debe a la intemperización del material parental y principalmente por actividades antropogénicas como la  deposición  de  residuos  industriales  y domésticos, relaves mineros, lodos de depuradora, aplicación de estiércol de ganado y aves, fertilizantes inorgánicos, cal, agroquímicos, agua de riego y pesticidas (Wang et al. 2015). Esto puede ocasionar un deterioro en las aguas subterráneas, en la calidad de los cultivos y a través de la cadena alimenticia, una potencial afectación en la salud humana de tipo cancerígeno, teratogénicos, genotóxicos y/o mutagénicos (Marrugo-Negrete et al. 2017; Hu et al. 2007; Cortés et al. 2015).

 

Algunos elementos son considerados esenciales como Co, Cu, Fe, Mn, Mo, Ni y Zn, indispensables para el óptimo funcionamiento y reproducción de microorganismos, plantas, animales,   incluido   el    hombre    (Sherameti y Varma 2010; Kabata-Pendias 2011). No obstante, al igual que los demás elementos que componen el grupo de metales pesados, a altas concentraciones pueden ser tóxicos para los organismos (Bolan et al. 2014).

 

Para evaluar el riesgo ecológico que puede ocurrir en suelos contaminados por metales pesados se realizan bioensayos que integran la exposición y los efectos de los contaminantes, que permiten representar sus interacciones con las diferentes propiedades físico-químicas y/o biológicas del suelo y evaluar los efectos de sus mezclas tanto en plantas como microorganismos (Chapman et al. 2012).

 

El presente trabajo tuvo como objetivo deter- minar la toxicidad de los metales pesados de Cu, Cd, Ni, Pb y Zn en dos suelos agrícolas colombianos de los órdenes Andisol y Vertisol,mediante bioensayos con la planta indicadora Lactuca sativa y la bacteria Vibrio fischeri en ex- tracto acuoso o solución del suelo, usando valores de referencia de dichos metales para suelos contaminados de Andalucía, España, con el fin de identificar su posible afectación a la biota del suelo y aportar a la estructuración de normati- vidad propia sobre la contaminación de suelos.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación fue llevada a cabo en el Laboratorio de Edafología  y  Química Agrícola y en el Centro de Instrumentación  Científica de la Universidad de Granada, España (Latitud: 37° 10´ 41´´N, Longitud: 3° 36´ 3´´O).

Se seleccionaron dos suelos agrícolas de Colombia, un Andisol Typic Melanudand tomado de la vereda La Aurelia, municipio de Cajibío (Latitud: 2° 37´ 26´´N, Longitud: 76° 34´ 23´´O), departa- mento del Cauca, y un Vertisol, Ustic Epiaquert en el Centro Experimental de la Universidad Nacional de Colombia, CEUNP, municipio de Candelaria (Latitud: 3° 24´ 35´´N, Longitud: 76° 20´ 52´´O), departamento del Valle del Cauca. Los suelos fueron muestreados a una profundi- dad de 0-20 cm, secados al aire y tamizados con malla No. 10 para determinar densidad aparente (Da, método del cilindro), pH del suelo (suelo:agua relación1:2,5), textura (Loveland y Whalley 1991), contenido de humedad, mineralogía de arcilla (Martín 2004), contenido de carbono or- gánico (CO) (IGAC 2006), bases intercambia-  bles y capacidad de intercambio catiónico (CIC, acetato de amonio 1N a pH 7), fósforo (Bray II), contenido total de Ni, Cu, Zn, Cd y Pb (digestión ácida; usando espectrofotómetro ICP-MS NE- XION 300D) (US EPA 1999),y elementos mayo- res (Fluorescencia de Rayos X en equipo Philips PW-1404) (Cortés et al. 2015).

Los suelos fueron contaminados de forma individual en el laboratorio con  los  metales  Ni, Cu, Zn, Cd y Pb; las soluciones  de  cada  uno de los metales se prepararon a partir de las siguientes sales: Cd(NO3)2, ZnCl2, Ni(NO3)2, Cu(NO3)3 y Pb(NO3)2, hasta superar los valores de referencia para el nivel de intervención de suelos agrícolas propuestos por la Junta de Andalucía: Ni (348 mg kg-1), Cu (626 mg kg-1), Zn (1265 mg kg-1), Cd (27 mg kg-1), y Pb (660 mg kg-1)  (CMAJA  1999).  Para  ambos  suelos se incluyeron muestras no contaminadas o control. Posteriormente, las muestras fueron incubadas bajo condiciones de invernadero, a una temperatura de 25 ºC y 60% de humedad del aire, en equipo GROW470/HR, simulando el ciclo diurno-nocturno de 12 horas, durante 60 y 90 días, y humedad gravimétrica del suelo del 60%. Las unidades experimentales en vasos plásticos Eppendorf de 50 cm3 contenían las muestras de suelo tratadas (5 g cada una). Todos los tratamientos se realizaron por triplicado. Se prepararon suspensiones de suelo: agua, relación 1:5 (peso: volumen), con las muestras de suelos contaminadas y no contaminadas, que fueron agitadas durante 12 horas; posteriormente se centrifugaron a 3000 r.p.m. El sobrenadante fue separado en dos porciones: la primera para la determinación de metales solubles en agua, en equipo ICP_MS NEXION 300D y la segunda para bioensayos de toxicidad, previa medición de pH  y conductividad eléctrica (CE) (USDA 1998).

Para este estudio fueron seleccionadas dos pruebas de toxicidad:

a. Prueba de germinación de semillas/ elongación de raíz, de acuerdo a las recomendaciones de la US EPA (1996). Este test evaluó el efecto fitotóxico en la germinación de las semillas y el crecimiento inicial de las plántulas. En cajas Petri, fueron incubadas a 25±1°C, 10 semillas de Lactuca sativa  con  5 ml de extracto acuoso de suelos contaminados con metales y después de 5 días se midieron el número de semillas germinadas y la longitud de las raíces en desarrollo. El criterio de valoración fue la reducción calculada en la elongación de la raíz (LsR) en comparación con el control.

b. Prueba de Microtox® se basó en la reducción de la luminiscencia (ASTM 2004), a 5 min y 15 min, después de la mezcla de la bacteria marina Vibrio fischeri con los extractos acuosos. La prueba se realizó en un analizador de Microtox 500 (Microbics Corporation), de acuerdo con modificación para extractos acuosos  (Martín  et al. 2010). Los resultados se expresaron como la reducción de luminiscencia (VfR) en comparación con el control.

Los valores del Índice de toxicidad (It) pueden variar desde <0 hasta 100 (máxima toxicidad), y con ellos se establecieron los siguientes cinco rangos de toxicidad (Escoto et al. 2007):

(a) < 0% toxicidad nula, indica la estimulación de la elongación radicular (mayor elongación en el tratamiento que en el agua destilada)

(b) 0 a 25% toxicidad baja,

(c) >25 a 50% toxicidad moderada,

(d) >50 a 75% toxicidad alta,

(e) >75 a 100% toxicidad muy alta.

 

La distribución normal de las variables fue establecida con la prueba de Kolmogorov- Smirnov.      Las      diferencias      significativas se determinaron mediante ANOVA y las comparaciones múltiples con la prueba de Duncan (p≤0,001). Se realizaron análisis de componentes principales con el fin de analizar la influencia de las propiedades del suelo en la capacidad de extracción y la toxicidad de los metales. Todos estos análisis se realizaron con un nivel de confianza del 95% mediante el uso de SPSS v.20.0 (SPSS Inc. Chicago, USA).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El Andisol es rico en arcillas amorfas (alófanos), textura franco limosa, pH moderadamente ácido como resultado del manejo con cal dolomita, altos niveles de CO, K y CIC, medios de Ca y Mg, normal en Na y C/N, baja saturación de bases y bajo contenido de fósforo soluble. Buen contenido de agua útil, y baja densidad aparente. El Vertisol presenta textura franco arcillosa, presencia de arcillas esmectitas (tipo 2:1), pH neutro, altos niveles de Ca, Mg y de   P disponible, normal en Na y K, alta densidad aparente, buen contenido de agua útil, baja CIC y baja relación C/N (Cortés et al. 2015). Ambos suelos presentan concentraciones de metales pesados dentro del rango normal de suelos agrícolas (Kabata-Pendias 2011) (Tabla 1).

 

 

 

Los extractos acuosos del Andisol se clasifican como ligeramente ácidos, en tanto que los del Vertisol se ubican dentro del rango considerado como de neutralidad de las aguas naturales (Tabla 2); así mismo, su conductividad eléctrica es alta e implica posibilidad de afectación de aguas superficiales y subterráneas.

 

 

Las concentraciones solubles de los  metales  en los extractos superan los  valores  críticos  de toxicidad para la solución del suelo (Bohn 1993), por lo que se les considera con alta capacidad de acumulación en los organismos   y fuerte toxicidad (Ayers y Westcot 1985; Real Decreto 927/1988; Real Decreto 140/2003; OMS 2006). El mayor  contenido  de  PbW  en el extracto del vertisol en relación con el del andisol, puede deberse al bajo contenido de óxidos de hierro y manganeso que posee este tipo de suelo, con los cuales este metal tiene alta afinidad (Cerqueira et al. 2011).

 

La menor concentración de ZnW en el vertisol está relacionada con el alto contenido de fósforo soluble, pues afecta el potencial eléctrico de los coloides haciéndolo más negativo (principalmente por los óxidos de hierro) y facilita la adsorción del metal (Pérez- Novo et al. 2011).

 

La germinación de lechugas en el control (agua destilada) fue del 97% y 100% en los periodos de incubación 1 y 2, respectivamente, por lo que se considera que la prueba es fiable (OECD 2006). No existen diferencias significativas (p>0,05) entre los distintos tratamientos, ni con respecto al control, infiriéndose que los metales en la solución del suelo no inhiben la germinación de la Lactuca sativa (no hay toxicidad).

 

De acuerdo al test de Duncan (p <0,001) (Figura 1) se encontró:

-Tratamientos sin efecto fitotóxico. En estos tratamientos, las elongaciones no difieren de las del blanco (suelo no contaminado) ni del control (agua destilada). Para los extractos del Andisol, periodo 1, los tratamientos son: Pb, Cu y Cd. Se produce hormesis (un fenómeno de relación entre la dosis y la respuesta, caracterizada por estimulación  a  bajas  dosis  e inhibición con altas dosis) para el Cd.

 

 

 

 

En el periodo 2, los tratamientos son: Pb, Cu, Ni y Zn. Se presenta hormesis para el Pb. Para los extractos del vertisol, en los dos periodos de incubación, los tratamientos son: Cu, Cd, Pb, Ni y Zn. En el periodo 1, la muestra de suelo no contaminado (blanco) presenta hormesis.

 

-Tratamientos con efecto fitotóxico. Estos efectos fitotóxicos sólo se presentan para los extractos del andisol, en el periodo 1, para Ni y Zn; y en el periodo 2, para el Cd.

 

La toxicidad en la L. sativa generada en el tratamiento ZnW (Tabla 3), se presentó de manera moderada en el   Andisol,   periodo  1, debido posiblemente a que la lechuga es sensible al pH ácido de la solución de dicho tratamiento, lo cual inhibe su crecimiento y metabolismo celular (Chapman et al. 2012).

 

El incremento de la toxicidad para el Cd en el andisol, periodo 2 de  incubación,  en  el  cual la concentración es menor, lo cual puede atribuirse a una posible desnitrificación (Cornu et al. 2008), así como a un cambio del potencial redox, al aumento de la conductividad eléctrica de la solución, y que por aumento de la acidez, este metal pudo generar el  desplazamiento de las sales de los sitios  de  intercambio  de  los coloides del extracto  acuoso,  generando  la inhibición del crecimiento de las plántulas (Rodríguez-Serrano et al. 2008).

 

El vertisol presentó la mayor capacidad de inhibición de la toxicidad de los metales pesados sobre la Lactuca sativa, debido posiblemente a que a mayor valor del pH se disminuye la movilidad y biodisponibilidad  de los metales, así como al mayor contenido de arcillas, cuya gran  superficie  específica  le confiere gran capacidad de adsorción de metales (Kabata-Pendias 2011).

 

El pH y la conductividad eléctrica de los extractos de los suelos están dentro del rango recomendado para realizar el bioensayo con Vibrio fischeri (Onorati y Mecozzi 2004). El Test de Duncan (p<0,001) aplicado a prueba de toxicidad por luminiscencia, a 5 y 15 minutos, para los dos periodos de incubación (Tabla 4), muestra que los tratamientos se diferencian en 2 grupos:

 

 

Tratamientos sin efecto fitotóxico. En estos tratamientos los valores de  luminiscencia  no difieren de las del blanco (suelo no contaminado) ni del control (agua destilada). Para el Andisol, en el periodo de incubación 1, a 5 y 15 minutos: Cd, Cu, Pb; a 15 minutos, además está el Ni, y para Cd y Cu se produce hormesis. En el periodo 2, a 5 y 15 minutos: Cd, Cu, Ni y Pb. Para Cd, Cu, Ni se presenta hormesis. Para el vertisol, en el periodo de incubación 1, a 5 y 15 minutos: Cd, Cu, Ni, Pb y Zn; en el periodo 2, a 5 y 15 minutos: Cd, Cu, Ni, Pb y Zn. 

Tratamientos con efecto fitotóxico. El efecto fi- totóxico sólo se presentan para el tratamiento con Zn, en el andisol, en ambos periodos de incubación, y para los dos momentos de medida.

De los índices de toxicidad para Vibrio fischeri (Tabla 3) se infiere que la capacidad de inhibición de la toxicidad de ambos suelos es alta, en virtud a que sus concentraciones son muy tóxicas para la solución del suelo (Bohn 1993) y para la bacteria (Hsieh et al. 2004). 

El vertisol presentó la mayor capacidad de inhibición de la toxicidad, debido posiblemente al mayor valor del pH, al mayor contenido y tipo de arcillas. 

El metal que influyó significativamente   en la inhibición de la luminiscencia  fue  el  Zn, que por su concentración, bajo radio iónico, naturaleza bactericida y antimicrobiana, pudo afectar fuertemente los sistemas enzimáticos de la bacteria (Fulladosa et al. 2005). No obstante, en ambos suelos se obtuvo nula toxicidad hacia la bacteria por parte de CdW, CuW, PbW, así como el NiW  en  el  vertisol,  debido  a  que las paredes celulares bacterianas funcionan como polielectrólitos, los cuales adsorben  los iones metálicos de la solución mediante atracción electrostática, complementada con fuerzas de Van der Waals, enlaces covalentes, interacciones redox y precipitación celular (Huang et al. 2008). 

El análisis de componentes principales (Figura 2) explica el 96,19% de la varianza; el 55,65% corresponde al componente  1,  y  el  40,54% al componente 2. En éste se observa que los parámetros de mayor influencia sobre la toxicidad de los organismos en ensayo (LsR, VfR5 y VfR15) son las concentraciones de los metales solubles y la conductividad eléctrica del extracto del suelo, lo cual indica que la concentración de los metales usada en estos ensayos afectan significativamente el desarrollo de la biota del suelo; por otra parte, la capacidad de intercambio catiónico se asocia al Fe, Al y CO y el pH al contenido de arcilla.

 

Los niveles de intervención para suelos basados en concentraciones totales de metales no representan criterio suficiente para declarar  un suelo como  contaminado  debido  a  que su movilidad depende de las propiedades de ellos, siendo importante el realizar pruebas de biodisponibilidad, bioensayos de toxicidad y de abundancia, diversidad, tolerancia y capacidad de remediación de la contaminación por parte de los organismos edáficos (Cortés et al. 2015; Sarria et al. 2015).

 

CONCLUSIONES

La capacidad de inhibición de la toxicidad de los suelos (andisol y vertisol) sobre la planta indicadora Lactuca sativa y la bacteria Vibrio fischeri es alta, dado que las concentraciones solubles de los metales se consideran toxicas en la solución del suelo; , dicha capacidad se incrementó con el tiempo, y se relacionó con la reducción de las concentraciones solubles de metales como resultado del incremento del pH que permitió una mayor fijación en las posicio- nes de adsorción del suelo (materia orgánica, arcillas, y complejos amorfos de Fe y Al).

El Vertisol presentó una mayor   capacidad de inmovilización de los metales pesados, reflejándose en una menor toxicidad sobre los organismos del bioensayo y actuando como un factor de protección contra la movilidad de los contaminantes en el suelo. Las propiedades del suelo que parecen haber sido más efectivas en dicha inmovilización fueron la arcilla y el pH.

El Zn fue el metal que influyó significativamente sobre la inhibición de   la   luminiscencia  de la bacteria Vibrio fischeri,  posiblemente  por  su mayor concentración, pH ácido y mayor movilización.

La bacteria bioluminiscente Vibrio fischeri mostró una mayor sensibilidad a todos los metales pesados evaluados, permitiendo una mejor discriminación de niveles de toxicidad. Más sin embargo, la interacción bacteria-metal es importante para deducir adecuadamente la toxicidad generada, ya que éstas poseen mecanismos de tolerancia ante la contaminación.

 

Agradecimientos

Ismael Vivas por proveernos los suelos del municipio de Cajibío, departamento del Cauca, al Departamento de Edafología de la Universidad de Granada, al Grupo de Investigación en Uso y Manejo de Suelos y Aguas de la Universidad Nacional de Colombia.

 

 

REFERENCIAS

 

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Rodríguez-Serrano, M., Martínez-De La Casa, N., Romero-Puertas, M. C., Del Río,L.A. y Sandalio, L. 2008. Toxicidad del Cadmio en Plantas. Ecosistemas 17 (3): 139-146.

 

Sarria, M., Cortés, L. y Martín, F. 2015. Evaluación de la recuperación de suelos contaminados por el vertido de Aznalcóllar. Acta Agronómica 64 (2): 156-164. https://doi.org/10.15446/acag. v64n2.44265.

 

Sherameti, I. and Varma, A. 2010. Soil Biology: Soil Heavy Metals. Volume 19. Springer- Verlag Berlin Heidelberg.

 

US EPA (Environmental Protection Agency). 1996. Ecological effects test guidelines, in: Seed Germination/Root Elongation To- xicity Test, US Environmental Protection Agency, Office of Prevention, Pesticide and Toxic Substances (OPPTS) 850.4200, Washington DC, EPA 712-C-96-154.

 

US EPA (Environmental Protection Agency). 1999. Method 3051: microwave assisted acid digestion of sediments, sludges, soils and oils.

 

Wang, Q., Xie, Z. and Li, F. 2015. Using ensemble models to identify and apportion heavy metal pollution sources in agricultural soils on a local scale. Environmental Pollution 206: 227-23